Skip to content

Fibroblast Growth Factor 23 w onkogennej osteomalacji i hipofosfatemii powiązanej z chromosomem X ad

1 miesiąc ago

505 words

Zatem mutacje zaburzałyby degradację FGF-23, a tym samym wzmacniałyby lub przedłużały jej aktywność biologiczną.3,6,8-10 Oprócz tego, że jest substratem dla enzymów typu furynowego, FGF-23 może również być substratem dla PHEX (białka regulującego fosforan z homologami do endopeptydaz kodowanych przez gen na chromosomie X), który jest zmutowany u pacjentów z X-ami. powiązana krzywa hipofosfatemiczna (numer OMIM 307800) .9,11,12 Różne mechanizmy molekularne – nadprodukcja FGF-23 przez nowotwory odpowiedzialne za osteomalację onkogenną, 2,3 generacji zmutowanego FGF-23, który jest oporny na cięcie przez skórę typu furynowego enzymy 2,3,6,8,10 i zaburzona degradacja FGF-23 z powodu zmniejszenia lub utraty aktywności PHEX9 mogą w ten sposób prowadzić do podwyższonych stężeń FGF-23 iw konsekwencji do utraty fosforanu w moczu.
Aby zbadać rolę FGF-23 w regulacji homeostazy fosforanowej, opracowaliśmy dwu lokacyjny enzymatyczny test immunoenzymatyczny (ELISA), który wykrywa karboksykońcową część FGF-23 i mierzyliśmy krążące stężenia tego wzrostu czynnik u osób zdrowych oraz u pacjentów z onkogenną osteomalacją lub hipofosfatemią sprzężoną z chromosomem X.
Metody
Synteza peptydów i produkcja przeciwciał
Peptydy zostały zsyntetyzowane przez Biopolymer Core Facility, Massachusetts General Hospital, Boston. Peptydy reprezentujące części prekursora FGF-23 – [Cys70] FGF-23 (51-69) amidu, [Tyr185] FGF-23 (186-206) amidu, [Tyr223] FGF-23 (206-222) amidu, oraz [Tyr224] FGF-23 (225-244) amid – sprzężono z hemocyjaniną skałoczepa, zemulgowano z pełnym adiuwantem Freunda i stosowano do podskórnej immunizacji ośmiu kóz (z około 100 ug na zwierzę); każdy peptyd był wstrzykiwany dwóm zwierzętom. Kolejne iniekcje przypominające (około 50 .g na zwierzę) wykonywano co cztery tygodnie peptydami zemulgowanymi z niekompletnym adiuwantem Freunda. Każdy peptyd był kowalencyjnie sprzężony z agarozą (AminoLink Kit, Pierce Chemical), a ilości od 30 do 200 ml każdej surowej poliklonalnej surowicy odpornościowej oczyszczono za pomocą powinowactwa z użyciem odpowiedniego unieruchomionego peptydu, jak opisano wcześniej.13
Generacja rekombinowanego FGF-23
Komplementarny DNA (cDNA) kodujący pełnej długości ludzki FGF-23 był amplifikowany przez łańcuchową reakcję polimerazy z biblioteki cDNA uzyskanej z wcześniej opisanego onkogennego nowotworu osteomalacji.2 Aby wyrazić rekombinowany FGF-23, produkt reakcji łańcuchowej polimerazy był zligowano do wektora pIZ / V5-His (zestaw do klonowania InsectSelect, Invitrogen) uzyskując plazmid zwany [V5-His] rhFGF-23 (1-251); dwa znaczniki epitopowe były umiejscowione na końcu karboksylowym kodowanego FGF-23; Sekwencja nukleotydowa konstruktu została następnie potwierdzona przez analizę sekwencji. Komórki owadzie Sf-9, które pozwalają na ekspresję białka o wysokim poziomie, następnie transfekowano (odczynnik do transfekcji Insectine-Plus, Invitrogen) z plazmidem [V5-His] rhFGF-23 (1-251). Transfekowane komórki utrzymywano w 25 ° C i selekcjonowano pod kątem oporności na zeocynę, antybiotyk z rodziny bleomycyny (300 .g na mililitr, Invitrogen). Poliklonalne linie komórkowe z wysokim poziomem ekspresji [V5-His] rhFGF-23 (1-251) ekspandowano i utrzymywano w 250-ml kolbach przędzalniczych z pożywką wolną od surowicy (Trichoplusia ni Medium Formulation Hink [TNF-FH], GIBCO ) uzupełniona o Zeocynę (50 .g na mililitr) i połączenie amfoterycyny B, penicyliny i streptomycyny
[podobne: www dialab pl, stomatologia estetyczna warszawa, metafedron wiki ]
[hasła pokrewne: mikrocytoza, metafedron wiki, www dialab pl ]

0 thoughts on “Fibroblast Growth Factor 23 w onkogennej osteomalacji i hipofosfatemii powiązanej z chromosomem X ad”